Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.
Разновидности реакции агглютинации (РА ) для выявления AT - кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хаддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).
Ориентировочная реакция агглютинации (РА)
Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки.
Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.
О-Аг . Соматические О-Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты.
Н-Аг . Н-Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками).
Vi-Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60-62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi-антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.
Реакции прямой гемагглютинации
Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов.
Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов из них.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.
Рис. 34. Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). А - получение эритроцитарного диагностикума: Б - РПГА: 1 - эритроцит: 2 - изучаемый антиген; 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену: 5 - агглютинат
Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).
Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.
При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.
Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.
Контрольные вопросы
1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?
2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?
Задание
Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.
Реакция преципитации
В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.
Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.
Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:
1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.
2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).
3. Изотонический раствор.
Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).
Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.
Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).
Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.
Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации
Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".
Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.
Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.
Контрольные вопросы
1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?
2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?
Задание
1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.
2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).
Реакция лизиса (иммунный цитолиз)
Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.
3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).
4. Изотонический раствор.
Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:
1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.
2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.
Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.
* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )
3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).
4. Изотонический раствор.
Таблица 19. Схема реакции гемолиза
Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,
В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).
Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:
Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.
Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)
В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.
При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.
Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.
Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.
Контрольные вопросы
1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?
2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?
Задание
Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.
Похожая информация.
11621 0
Серологические реакции обозначают в соответствии с феноменами, сопровождающими образование комплекса антиген — антитело при взаимодействии различных по свойствам компонентов. Различают реакции агглютинации, преципитации и лизиса.
Реакция агглютинации (РА)
Реакция агглютинации (РА) основана на применении корпускулярного антигена (взвесь бактерий, сенсибилизированных эритроцитов, частиц латекса и др.), взаимодействующего со специфическими антителами, в результате чего образующийся комплекс антиген - антитело выпадает в виде осадка. Эту реакцию широко применяют в лабораторной практике для серологической диагностики бактериальных инфекций и для идентификации выделенных микроорганизмов.
РА используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза (реакции Райта, Хеддльсона), туляремии, лептоспироза (РАЛ - реакция агглютинации и лизиса лептоспир), листериоза, сыпного тифа (РАР - реакция агглютинации риккетсий), шигеллеза, иерсиниоза, псевдотуберкулеза и др.
Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РИГА или РПГА).
Для постановки этой реакции используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морских свинок, некоторых птиц), сенсибилизированных антителами или антигеном, что достигается инкубацией взвеси эритроцитов и раствора антигена или иммунной сыворотки.
Диагностикумы, полученные на основе эритроцитов, сенсибилизированных антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами . Они предназначены для определения антител в серийных разведениях сывороток крови, например эритроцитарные шигеллезные диагностикумы, эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы.
Соответственно диагностикумы на основе эритроцитов, сенсибилизированных специфическими иммуноглобулинами, называют антительными (иммуноглобулиновыми) диагностикумами и они служат для выявления антигенов в различном материале, например эритроцитарный иммуноглобулиновый дифтерийный диагностикум для РИГА, применяемый для выявления дифтерийного экзотоксина коринебактерий в жидкой питательной среде при посеве в нее материала из носа и ротоглотки.
Реакцию гемагглютинации применяют для диагностики как бактериальных (брюшной тиф, паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), так и вирусных (грипп, аденовирусные инфекции, корь и др.) инфекций. По чувствительности и специфичности РИГА превосходит РА.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют для титрования противовирусных антител в сыворотках крови, а также с целью установления типовой принадлежности выделенных вирусных культур. РТГА можно применить для диагностики тех вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.
Принцип метода состоит в том, что сыворотка, содержащая антитела к конкретному типу вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность и эритроциты остаются неагглютинированными.
Реакция торможения (задержки) пассивной гемагглютинации (РТПГА).
В РТПГА участвуют три компонента: иммунная сыворотка, антиген (исследуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты.
Если в исследуемом материале есть антиген, специфически реагирующий с антителами иммунной стандартной сыворотки, то он связывает их, и при последующем добавлении эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, гомологичным сыворотке, гемагглютинация не наступает.
РТПГА применяют для обнаружения микробных антигенов, для количественного их определения, а также для контроля специфичности РПГА.
Реакция латекс-агглютинации (РЛА)
В качестве носителя антител (иммуноглобулинов) используют частицы латекса. РЛА является экспресс-методом диагностики инфекционных болезней, учитывая время проведения (до 10 мин) и возможность обнаружить антиген в небольшом объеме исследуемого материала.
РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной жидкости, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода составляет 1-10 нг/мл, или 10³ -10⁶ бактериальных клеток в 1 мкл.
Реакция коагглютинации (РКоА)
Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А стафилококков присоединять специфические иммуноглобулины. РКА - метод экспресс-диагностики - служит для выявления растворимых термостабильных антигенов в секретах человека и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Обнаружение специфических антигенов в составе ЦИК требует их предварительного осаждения из сыворотки крови.
Реакция преципитации
В реакции преципитации (РП) в результате взаимодействия антител с высокодисперсными растворимыми антигенами (белки, полисахариды) образуются комплексы с участием комплемента - преципитаты. Это чувствительный тест, используемый для выявления и характеристики разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной РП является образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку - реакция кольцепреципитации. Широко применяют различные разновидности РП в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез).
Реакция связывания комплемента (РСК)
Реакция связывания комплемента (РСК) основана на феномене гемолиза с участием комплемента, т.е. способна выявлять только комплементсвязывающие антитела.
РСК широко применяют для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций, риккетсиозов, хламидиозов, инфекционного мононуклеоза, протозойных инфекций, гельминтозов. РСК является сложной серологической реакцией, в которой участвуют две системы: исследуемая (сыворотка крови), представленная системой антиген - антитело и комплементом, и гемолитическая (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Гемолитическая сыворотка представляет собой инактивированную прогреванием сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Она содержит антитела против эритроцитов барана.
Положительный результат РСК - отсутствие гемолиза - наблюдают в случае, если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену. При этом образовавшийся комплекс антиген - антитело связывает комплемент, а в отсутствии свободного комплемента добавление гемолитической системы не сопровождается гемолизом. В случае отсутствия в сыворотке антител, соответствующих антигену, образования комплекса антиген - антитело не происходит, комплемент остается свободным и сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов, т.е. наличие гемолиза - это отрицательный результат реакции.
Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.
В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.
Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунопогического состояния привитых. У больных туляремией aнтитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:100000- 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.
У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80.
Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ноq концентрации.
Техника постановки РПГА. Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град.С в течение 30 минут. После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.
Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины. При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6-лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок). После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном - с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.
Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме:
1) резко положительная реакция (++++) - эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев;
2) положительная реакция (+++) - эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки;
3) слабоположительная реакция (++) - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;
4) сомнительная реакция (+) - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината;
5) отрицательная (-) - на дне лунки эритроциты оседают в виде «пуговки» или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.
Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА необходимо проследить за его нарастанием.
РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.
Техника постановки РПГА в микрообъемах. РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.
Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки - капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.
В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума. Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе. Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.
Учет реакции производят по следующей схеме:
1) «+» – полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», занимающего не менее 2/3 дна;
2) «+-« - частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера;
3) «-« – отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой пуговки или колечка с ровным краем.
Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции – реакции mторможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).
Техника постановки РТПГА. Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок. Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титровании Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда - по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий. Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз. Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.
Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.
Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи. Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забивают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремиймого антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй - 25 мкл разводящей жидкости. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного зритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации). Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.
Реакция торможения гемагглютинации
Реакция гемагглютинации
Реакция агглютинации
Реакция агглютинация (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора натрия хлорида). Образовавшийся осадок называют агглютинатом.
Для реакции необходимы:
1. Антитела (агглютинины) - находятся в сыворотке больного или в иммунной сыворотке.
2. Антиген - взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или других клеток.
3. Изотонический раствор.
Реакцию агглютинации для серодиагностики широко применяют при брюшном тифе, паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта) и др. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном - известный микроб.
При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют при диагностике кишечных инфекций, коклюша и др.
В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации (РГА).
Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.
Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита - эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.
Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом, (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Высокая специфичность реакции торможения гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.
Рис. Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). А - получениеэритроцитарного диагностикума; Б - РНГА: 1-эритроцит: 2 - изучаемый антиген; 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело изучаемому антигену: 5 - агглютинат.
При помощи РНГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.
Загрузка...