Ртга реакция торможения гемагглютинации применяется для. Реакция торможения гемагглютинации

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее лучше так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

5 Реакция нейтрализации вирусов . Данная реакция используется для идентификации вирусов. Для этого к исследуемому материалу, содержащему неизвестный вирус, добавляют специфическую противовирусную сыворотку. После инкубации эту смесь вводят либо в куриный эмбрион, либо лабораторному животному, либо в культуру клеток. Наиболее распространена реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток. Здесь в культуральную среду добавляется индикатор. Если антитела соответствуют вирусу (нейтрализуют его), то клеточная культура развивается нормально. При этом происходит выделение кислых продуктов клеточного метаболизма, рН среды снижается, и индикатор изменяет свой цвет. В контроле вирус быстро разрушает клеточную культуру, рН не меняется, и цвет среды остается прежним.

РЗГА (РТГА) - высокоспецифическая серологическая реакция, позволяющая решить следующие задачи: определить титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить степень антигенного родства двух гемагглютинирующих вирусов. РЗГА широко используют для ретроспективной диагностики некоторых вирусных инфекций (грипп, парагрипп КРС, вирусный аборт овец и др.). Для этого используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 2...3 недели, и по приросту титра антител в 4 и более раз определяют заболевание.

Достоинства РЗГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток - РЗГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Сущность РЗГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штаммами вируса происходит задержка (торможение) гемагглютинирующей способности вируса. На результат РЗГА влияют неспецифические ингибиторы гемагглютинации, содержащиеся в сыворотках крови. Они обладают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить гемагглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.

КомпонентыРЗГА: исследуемый вируссодержащий материал; диагностическая иммунная сыворотка; 1%-ная взвесь эритроцитов; 2-й вариант- исследуемая сыворотка крови; стандартный антиген (вирусный диагностикум); 1%-ная взвесь эритроцитов.

При постановке реакции следует иметь в виду, что некоторые жидкости организма (сыворотки крови, моча, слюна, молоко и др.) могут содержать ингибиторы, которые могут тормозить реакцию и задерживать гемагглютинацию. В этих случаях нормальная сыворотка, то есть сыворотка от здоровых животных, может дать задержку гемагглютинации, что приведет к ошибочным результатам. В сыворотках крови некоторых здоровых людей и животных выявлено два типа ингибиторов - термостабильные и термолабильные. Термолабильные ингибиторы обнаруживаются в (бета-фракциях глобулина и они обладают свойствами бета-глобулина, подавляют гемагглютинацию, нейтрализуют вирус и являются важным фактором противовирусного иммунитета. Они мешают постановке РЗГА и от них избавляются инактивированием сыворотки при 56-65°С в водяной бане 30 минут. Термостабильные ингибиторы (ингибиторы Френсиса) содержатся в а-фракциях глобулина, они устойчивы к высоким температурам (даже к кипячению) и действию щелочи, подавляют гемагглютинацию, но вирусонейтрализующими свойствами не обладают. Удаляют термостабильные ингибиторы из сыворотки крови обработкой сывороток углекислым газом, фильтратом культуры вибриона холеры или перийодатом калия.
Для постановки РЗГА необходимо предварительно провести титра-цию вируса в РГА, чтобы определить 1 АЕ. При постановке РЗГА вирус берут в титре 4 АЕ, то есть разведение в 4 раза меньше, чем был титр вируса в РГА. Например, титр вируса, содержащий 1 АЕ, равен 1:64, значит 4 АЕ будет содержаться в разведении вируса 1:16.
Все сыворотки перед постановкой РЗГА прогревают для удаления термолабильных ингибиторов в течение 30 минут при температуре 56 -65° С в зависимости от вида животных
Для постановки реакции в одном ряду пробирок или лунок готовят разведения сыворотки на физиологическом растворе. Обычно в первой пробирке готовят разведение 1:10, а далее из него 2-кратные разведения до 1:1280 и иногда более высокие. Затем из этого ряда по 0,25 мл соответствующих разведению сыворотки переносят во второй ряд пробирок и туда же добавляют по 0,25 мл вируса, содержащего 4 АЕ. Встряхиванием пробирок жидкость перемешивают и смесь выдерживают 30-60 минут в контакте при комнатной температуре или в термостате, после чего в каждую пробирку вносят по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, пробирки после этого встряхивают и вновь выдерживаю г смесь в комнате 30-60 минут.

Реакция задержки гемадсорбции (РЗГад).

Ее применяют для обнаружения, идентификации и типизации вирусов в зараженной культуре клеток.

Суть ее состоит в том, что антитела иммунной сыворотки, взаимодействуя с антигеном гемагглютинирующих вирусов, размножающихся в культуре клеток, экранируют их, и в результате адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток не наблюдается.

Компоненты реакции: 1) инфицированная и неинфицированная гемагглютинирующим вирусом культура клеток в пробирках; 2) Диагностическая противовирусная сыворотка; 3) 0,4%-ная взвесь эритроцитов кур.

Техника постановки. Из пробирок с культурой клеток сливают питательную среду, отмывают клетки от ее белковых компонентов, добавляя в пробирки 2-3 мл раствора Хенкса. После 1...2 мин экспозиции раствор Хенкса удаляют. Затем в каждую опытную и контрольную пробирки вносят по 0,2 мл диагностической сыворотки. Пробирки оставляют в наклонном положении, полосой вверх, и выдерживают при комнатной температуре 15...20 мин. Затем добавляют по 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов и снова оставляют на 3...5 мин в наклонном положении при комнатной температуре. В дальнейшем пробирки осторожно вращают 5-10 раз с целью ресуспендирования осевших, но не адсорбировавшихся эритроцитов.

1.Реакция гемагглютинации

(РГА)

метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на наличии у некоторых вирусов способности избирательно агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

В основе РГА лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию. При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

Использование РГА

РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемагглютинирующих единиц - АЕ).

Адсорбция вирусов

Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок.

Антиген для РГА

В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, материал из зараженных КЭ, культур ткани и др.), в котором предполагается наличие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.

Постановка ориентировочной РГА

Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю вирусосодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой.

Оценка реакции РГА

Оценивают реакцию в крестах (плюсах). При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осадка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробирки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста

2. Реакция торможения гемагглютинации - серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими видами вирусов (аденовирусами, арбовирусами, некоторыми энтеровирусами, вирусами гриппа и парагриппа, кори, реовирусами). Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов.

В последнее время реакция широко используется в лабораториях клинической вирусологии для определения титров специфических антител к тем или иным вирусам, а также для серологической идентификации и типирования изолятов вирусов из клинического материала от больных. Используют несколько ограничено в силу наличия в сыворотке крови людей неспецифических ингибиторов вирусов, а также естественных антител - агглютининов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Несмотря на своё название, принцип реакции во многом аналогичен РН вирусов, так как основан на способности AT связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Реакция торможения гемагглютинации

(РТГА)

метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

Реакция торможения гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

3. Серологическое исследование позволяет поставить диагноз в случае обнаружения специфических антител в сыворотке больных. Для серологических реакций используют парные сыворотки, которые берут в первые дни от начала заболевания и спустя 1 - 3 недели, но изучают одновременно. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более. РТГА, РН, РСК, РТГадс, РИФ, РИА, ИФА ставят с антигенами (диагностикума-ми), приготовленными из эталонных штаммов соответствующих вирусов.

4. Парные - это значит, что кровь дважды берут с каким-то интервалом времени. По нарастанию титра антител определяют, что заражение произошло. Если титр антител не меняется, значит, эти антитела в организме уже давно, свежего заражения нет.

Наибольшую диагностическую ценность представляет исследование парных сывороток, взятых от животных в начале и в конце заболевания (с промежутком в 14-21 день). Сыворотку отбирают в стерильные пробирки и хранят для исследования.

Описание

Набор для диагностики парвовирусной болезни свиней предназначен для обнаружения парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов абортированных плодов в реакции гемагглютинации (РГА) и специфических антител в сыворотке крови свиней, а также новорожденных поросят (до приема молозива) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Реакцию ставят микрометодом в лунках полистироловых пластин.

полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций;

антиген специфический инактивированный, обладающий гемагглютинирующей активностью не ниже 1:128;

сыворотка специфическая, обладающая активностью в РТГА не ниже 1:256;

сыворотка нормальная (отрицательный контроль).

Время проведения анализа:

РГА – 2,5-3,5 часа, РТГА – 3,5-4,5 часа (не учитывая время подготовки материалов для исследования).

Принцип метода:

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на склеивании взвешенных в жидкости эритроцитов под воздействием гемагглютинирующих свойств вируса и образования рыхлого осадка в виде зонтика. Сущность РТГА заключается в нейтрализации гемагглютинирующих свойств вируса специфическими антителами, содержащимися в сыворотке крови, в результате чего не происходит склеивания эритроцитов и они оседают на дно, образуя плотный осадок в виде пуговки.

Условия хранения

Набор хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С.

После растворения компоненты набора можно хранить в замороженном состоянии в течение 1 месяца, повторное замораживание не допускается.

Срок годности

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

Реакцию агглютинации можно проводить в микроварианте в ячейках 96-луночного планшета для иммунологических исследований с коническим дном. В лунки планшета вносят по 0,05 мл ФСБ (рН 7,2-7,4) и готовят двукратные разведения испытуемых сывороток крови от 1:2 и выше. Затем в каждую ячейку вносят по 0,005 мл суспензии грибных клеток в концентрации 100 тыс. грибных клеток в 1 мл. Планшет осторожно встряхивают и выдерживают 2 часа в термостате при 37°С, а затем 16-18 часов - при 4°С. В качестве отрицательного контроля используют нормальную (негативную) сыворотку крови и ФСБ.

Результаты реакции учитывают с помощью микроскопа и визуально и определяют в крестах по следующей схеме:

(++++) - полное просветление жидкости и образование агглютината на дне лунки в виде перевернутого "зонтика", при встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья;

(+++) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный "зонтик";

(++) - заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен умеренно;

(+) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик" выражен слабо;

(-) - отрицательный результат, просветление жидкости не наступило, на дне лунки осадок в виде пуговки, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.

За титр антител принимали последнее разведение испытуемой сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в два креста (++).

№ 83 Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.
Иммуноферментный анализ или метод - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (10 10 -10 12 г/л).

Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного . Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Существует множество методов качественного и количественного определения вирусоспецифических антител. С помощью этих методов можно обнаружить как IgM и IgG одновременно, так и отдельно иммуноглобулины каждого класса. Как правило, в реакции связывания комплемента выявляются только вирусоспеци-фические IgG. Однако при тестировании этим методом микробиологических антигенов возможно одновременное определение специфических IgM и IgG.

Иммунологические методы используются главным образом в двух целях: во-первых, для диагностики текущей, завершившейся или врожденной вирусной инфекции и, во-вторых, для обнаружения специфических антител, присутствие которых указывает на прошедшую инфекцию и, следовательно, на иммунитет к возможной повторной инфекции. По силе иммунного ответа на вирусную инфекцию люди сильно отличаются друг от друга. На рис. 3 показана типичная кривая нарастания титра

антител в ответ на первичную инфекцию краснухи. Легко заметить, что установление диагноза краснухи возможно по нарастанию титра специфических IgG и выявлению специфических IgM. Присутствие специфических IgM в крови новорожденного свидетельствует о внутриматочном инфицировании, поскольку материнские IgM в отличие от IgG задерживаются плацентой. Специфические IgG, образовавшиеся в результате первичной инфекции, обычно сохраняются в течение всей жизни. Поэтому присутствие антител этого класса в сыворотке крови свидетельствует об иммунитете к соответствующей повторной инфекции.

Ниже приведены иммунологические методы обнаружения специфических антител к вирусу краснухи, особенно эффективные для диагностики заболевания плода и определения титра специфических антител в сыворотке крови. Подробные описания методов, используемых для диагностики краснухи, можно найти в обзорах Паттисона и Моргана-Капнера.

Реакция торможения гемагглютинации

Вирус краснухи вызывает гемагглютинацию эритроцитов многих видов животных. Чаще всего в РТГА используют эритроциты однодневных цыплят. Гемагглютинирующим антигеном вируса краснухи при постановке этой реакции служит выращенный в культуре и обработанный Твин 80 и эфиром вирус. Предварительная обработка увеличивает ГА-титр вируса.

5.1.1 Стандартизация ГА-антигена вируса краснухи

1. 1 мл 50%-ной суспензии эритроцитов цыплят трижды промывают в вероналовом буфере с декстраном и желатином центрифугированием и ресуспендированием осадка в 15-мл градуированной центрифужной пробирке. Отмытые клетки ресуспендируют в DGV-буфере для получения 30%-ной суспензии.

Таблица 3. Приготовление вероналового буфера с декстраном и желатином

1. DGV-буферный раствор

Таблетки буфера для реакции 20 связывания комплемента

Веронал натрия 400 мг Желатин 1200 мг Дистиллированная вода 2000 мл Растворяют таблетки в дистиллированной воде. Добавляют веронал натрия и желатин. Помещают в водяную баню при 56 °С до полного растворения желатина. Разливают во флаконы по 100 мл. Автоклавируют и хранят при 4 °С

2. 25%-ный БСА

БСА, фракция 5 25 г Стерильная дистиллированная 100 мл вода

Стерилизуют фильтрованием, разливают по 1 мл в стерильные ампулы. Хранят при --20 "С

3. 10%-ная глюкоза

Глюкоза 10 г Дистиллированная вода 100 мл Разливают по 1 мл. Автоклавируют и хранят при 4 °С

4. Для использования

DGV-буферный раствор 100 мл 25%-ный БСА 0,8 мл 10%-ная глюкоза 1,0 мл Хранят при 4°С

2. Разводят лиофилизированный препарат ГА-антигена вируса краснухи в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды.

3. В каждую из восьми лунок двух соседних рядов 96-луноч-ного полистиролового планшета для микротитрования с U-об-разными лунками вносят по 1 объему DGV.

4. В первые лунки двух рядов вносят по одному объему ГА-антигена вируса краснухи.

5. Готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена вируса краснухи, начиная от 1:2 и до 1:256, используя 0,025-мл микротитратор. Перед употреблением головку микро-титратора следует прокалить в пламени докрасна, затем остудить в течение нескольких секунд, поместить в дистиллированную воду и промакнуть фильтровальной бумагой.

6. В каждую из заполненных лунок дополнительно вносят по одному объему DGV-буфера. В качестве контроля в лунки 12 первых двух рядов вносят по два объема DGV-буфера.

7. Суспензию отмытых эритроцитов цыплят разводят в 100 раз DGV-буфером, получая таким образом 0,03%-ную суспензию.

8. Во все 18 лунок добавляют по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов, готовый планшет закрывают другим, неиспользованным планшетом и инкубируют 1 ч при 4 °С.

9. На дне контрольных лунок образуется плотная «бляшка» неагглютинированных эритроцитов. Агглютинированные эритроциты оседают равномерно. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена вируса краснухи, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое разведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.

Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы антигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 25--48 ч при 4 °С.

5.1.2 Предварительная обработка сыворотки

Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемаг-глютинации, которые следует удалить. Неспецифические ингибиторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином. В сыворотках человека, кроме того, могут присутствовать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Однако предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритроцитами не является обязательной, поскольку все неспецифические гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнаруживаются в контролях.

1. В стеклянные пронумерованные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в каждом опыте необходимы положительные и отрицательные контроли.

2. В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного каолина на боратно-солевом буфере.

3. Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.

4. Отработанный каолин осаждают центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин 20 мин.

5. Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробирки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные в четыре раза. Их используют для постановки реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °С в течение ночи.

5.1.3 Реакция торможения гемагглютинации

1. Для тестирования одного образца сыворотки вносят по одному объему DGV в один ряд лунок.

2. В первую и последнюю лунки добавляют по одному объему сыворотки, разведенной в четыре раза.

3. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

4. В лунки 1--10 вносят по одному объему ГА-антигена краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 ГА-антиген краснухи не добавляют.

5. В лунки 1--8 другого планшета вносят по одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-антигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго рядов вносят по два объема DGV.

6. Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.

7. Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1 -- 1,5 ч при 4 °С.

8. Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена краснухи. В контрольных лунках агглютинация не должна произойти.

9. Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсутствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное тестирование исходного разведения сыворотки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей 30%-ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной температуре, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.

10. Титром специфических антител в исследуемой сыворотке считают обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация.

5.1.4 Интерпретация результатов

При невысоком титре интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.