Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
Использование сорбированных диагностических препаратов основано на постоянно реализуемом в природе принципе иммунологического распознавания поверхностных структур. С этой точки зрения нет принципиальных различий между использованием, например, микробной клетки или искусственного носителя, нагруженных антигеном (антителами). В качестве основы сорбированных препаратов применяются различные носители - микробные клетки, эритроциты, латекс, бентонин, холестерин, сефадекс, дерматол, активированный уголь, споры грибов и т.д.
После работ А.Т.Кравченко (1945) наибольшее распространение в качестве носителя антигена или антител получили лишенные жизнеспособности и фиксированные различными химическими реагентами эритроциты. На принципе использования в качестве носителя антигена эритроцитов (как нативных, так и фиксированных) широкое распространение получила реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.
Предложение об использовании реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностических целях возникли на базе предварительно развитых знаний о высокой сорбиционной активности эритроцитов. По сравнению со многими другими носителями антигенов и антител в реакции непрямой гемагглютинации эритроциты имеют определенные преимущества. Во-первых, в изотонических солевых растворах они образуют довольно стойкое сцепление и не оседают за короткое время. Во-вторых, эритроциты одного и того же вида животных одинаковы по размеру. И, наконец, эритроциты сравнительно легко непосредственно или в результате специальной обработки присоединяют различные серологически активные компоненты.
Создание эритроцитарных диагностикумов из стабилизированных эритроцитов позволяет преодолеть те трудности, которые возникают при использовании нативных эритроцитов.
При исследовании эритроцитов, обработанных различными фиксирующими веществами, установлены некоторые их общие свойства:
По морфологии они практически не отличаются от свежих;
Не гемолизируются в гипотонических растворах, в воде и после замораживания-оттаивания;
Могут быть лиофильно высушены;
Их поверхностные структуры сохраняют способность химически модифицироваться (например, танином, диазосоединениями) и вступать в реакцию с антигенами и антителами.
Главный критерий качества фиксированных эритроцитов - возможность их использования для получения сенсибилизированных препаратов при отсутствии неспецифического склеивания в стабилизирующих жидкостях.
Подготовка поверхности эритроцитов с целью повышения сорбиционной способности к антигенам имеет важное значение при конструировании диагностических препаратов. Особенно широкое распространение получила обработка эритроцитов танином.
Под его влиянием изменяются антигенные свойства эритроцитов (проницаемость, скорость оседания), повышается их устойчивость к гемолитическому воздействию некоторых жирных кислот. Достигается, однако, главное - танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбиционной емкостью белков, что широко используется в настоящее время при изготовлении высококачественных антигенных и антительных диагностикумов.
Наряду с танизацией эритроцитов, для изготовления эритроцитарных диагностикумов и подготовки носителя антигена применяются такие химические реагенты, как бромелин, триопсин, перйодат калия, которые также модифицируют мембраны эритроцитов.
После подготовки поверхности эритроцитов идет наиболее важный процесс - процесс гемосенсибилизации - окончательный этап изготовления эритроцитарных диагностикумов.
Для упрочения связи между носителем и антигеном применяются различные конъюгирующие вещества - бисдиазобензидин, дифлуородинитробензин, хлористый циан, хлористый и уксуснокислый кадмий, хлорид брома, формальдегид, глютаровый альдегид, бромциан, риванол, амидол и др.
Использование конъюгирующих веществ способствует устранению тех недостатков, которые имеют танизированные эритроциты, применяемые для сенсибилизации без конъюгирующих веществ.
Наиболее широкое применение нашли такие конъюгирующие вещества, как хлорид хрома, глутаровый альдегид, диазоль черный С, амидол. Процесс сенсибилизации с помощью хлорида хрома происходит очень быстро - от 4 до 10 мин., чем привлекает внимание исследователей. При этом используются концентрации хлорида хрома от 0,05 до 2%, pH - не ниже 5,0 при температуре реакционной смеси 20- 250 С. В процессе сенсибилизации хлоридом хрома активизируются карбоксильные группы белков мембраны эритроцитов. В результате этого образуется ковалентная связь между мембраной эритроцитов и сенситином.
Реакция непрямой гемагглютинации обладает высокой специфичностью, поскольку склеивание эритроцитов наступает в результате взаимодействия антигена с антителами, адсорбированными на эритроцитах. Отличительной ее особенностью является высокая чувствительность: в ней выявляется 0,02-0,05 мкг белка антител. По чувствительности она значительно превосходит реакции иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, радиальной иммунодиффузии, связывания комплемента, нейтрализации. РНГА менее чувствительна, чем методы радиоиммуноэлектрофореза, определения количества белка радиоактивных антител в иммуносорбенте, иммуноферментного анализа.
К достоинствам РНГА следует отнести достаточно высокую воспроизводимость, простоту выполнения, потребность в минимальных количествах ингредиентов, особенно при использовании микрометода.
РНГА в последние годы нашла широкое применение при диагностике инфекционного ринотрахеита, диареи, аденовирусной инфекции, рота- и коронавирусной инфекции, парагриппа - 3 и респираторно – синцитиальной инфекции.
Приводим пример изготовления и применения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к рота- и коронавирусной инфекции.
Методика приготовления антительных диагностикумов для выявления рота- и коронавирусных антигенов в РНГА состоит в следующем: получение суспензии эритроцитов; фиксация их акролеинов; танизация, позволяющая получить стабильную сорбцию необходимого белка на эритроцитах; сенсибилизация танизированных эритроцитов иммуноглобулинами; определение специфичности приготовленного диагностикума. Приготовление суспензии эритроцитов осуществляется путем отбора крови клинически здорового барана в колбу со стеклянными бусами. После дефибринирования крови эритроциты должны быть отмыты 3-5 раз изотоническим (0,9%-ным) раствором натрия хлорида путем центрифугирования в течение 15-20 мин при 400g.
В целях стабилизации эритроцитов проводится их обработка акролеином. Как известно, его действие несколько мягче, чем формальдегида, и обеспечивает стабильность и более высокую активность эритроцитов. Для этого равные объемы 10%-ной взвеси эритроцитов смешивают с 0,2%-ным раствором акролеина, приготовленного на фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,2. Полученную суспензию выдерживают в течение 30 мин при 37°С, тщательно перемешивая, с последующим освобождением от акролеина многократным центрифугированием в течение 5 мин при 600-800g до полного исчезновения специфического запаха. Преимущество приготовленных таким образом эритроцитов заключается в том, что они заготавливаются впрок, могут длительное время сохраняться, не подвергаясь гемолизу.
В дальнейшем стабилизированные эритроциты в 10%-ной концентрации выдерживают при 2-4 °С в ФБР с рН 7,2 в течение двух месяцев.
Для повышения сорбционной способности и осаждаемости эритроцитов необходимо провести их танизацию путем смешивания равных частей 10%-ной суспензии отмытых эритроцитов и раствора танина на ФБР и рН 7,2 в разведении 1:30000. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 370 С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от танина дважды в ФБР с рН 7,2 и трижды изотоническим раствором натрия хлорида с рН 7,2-7,4.
Оптимальным сроком гарантирующим получение качественных эритроцитарных диагностикумов является их сенсибилизация в течение 24- 48 часов после их обработки танином.
В процессе изготовления диагностикумов в качестве растворителя и консерванта используют 0,3%-ный фенолизированный изотонический раствор натрия хлорида с 0,1%-ной нормальной кроличьей или лошадиной сывороткой, предварительно инактивированной при 56°С в течение 30 мин и адсорбированной нормальными эритроцитами барана при 37°С в течение 30 мин.
Сенсибилизацию танизированных эритроцитов следует осуществлять гипериммунной сывороткой соответственно против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота (производимой во Всероссийском НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко). При этом сенсибилизирующая доза (концентрация белка) антиротавирусной иммунной сыворотки составляет 280 мкг/мл, а иммунной сыворотки к коронавирусу -260 мкг/мл.
Сенсибилизацию проводят, смешивая равные объемы танизированных эритроцитов и предварительно прогретой в течение 30 мин при 560С иммунной сыворотки в оптимальной концентрации. Кроме того, вносят 3 части изотонического раствора натрия хлорида с рН 7,2 и 5 частей 0,1%-ного раствора хлорида хрома. Смесь, периодически помешивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. По истечении указанного времени смесь тщательно отмывают с использованием ФБР с рН 7,2, а затем приготовленные эритроцитарные диагностикумы ресуспендируют в консерванте до 1%-ной концентрации. Приготовленный диагностикум сохраняет свои основные качества в течение 8 мес., при условии хранения его при 4°С.
На всех этапах изготовления диагностикумов осуществляют контроль на самоагглютинацию. Специфичность приготовленных диагностикумов определяют путем постановки РНГА, где в качестве антигенов использовали стандартные диагностикумы вирусов ИРТ, ПГ - 3, аденовирусов, вирусной диареи, а также антигенов рота- и коронавирусов.
При постановке РНГА готовят последовательные двойные разведения исследуемого вируссодержащего материала (20-50%-ная суспензия проб фекалий), а затем в каждую лунку вносят равный объем эритроцитарного диагностикума. Плашки следует тщательно встряхнуть несколько раз, оставить при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов в контроле. Показатель положительной реакции - агглютинация эритроцитарного диагностикума с интенсивностью агглютинации на 2+ в титре 1:4 и выше.
В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.
Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунопогического состояния привитых. У больных туляремией aнтитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:100000- 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.
У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80.
Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах - в 0,5%-ноq концентрации.
Техника постановки РПГА. Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град.С в течение 30 минут. После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием. Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.
Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины. При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6-лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок). После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном - с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.
Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме:
1) резко положительная реакция (++++) - эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев;
2) положительная реакция (+++) - эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки;
3) слабоположительная реакция (++) - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;
4) сомнительная реакция (+) - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината;
5) отрицательная (-) - на дне лунки эритроциты оседают в виде «пуговки» или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.
Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов). Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА необходимо проследить за его нарастанием.
РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.
Техника постановки РПГА в микрообъемах. РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.
Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки - капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.
В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума. Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе. Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.
Учет реакции производят по следующей схеме:
1) «+» – полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», занимающего не менее 2/3 дна;
2) «+-« - частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера;
3) «-« – отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой пуговки или колечка с ровным краем.
Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции – реакции mторможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).
Техника постановки РТПГА. Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок. Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титровании Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда - по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий. Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз. Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола. Учет производят через 2-3 часа.
Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена. Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.
Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи. Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забивают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремиймого антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй - 25 мкл разводящей жидкости. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного зритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации). Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.
1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.
Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых планшетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кружевного зонтика», при отрицательной реакции - плотный осадок эритроцитов в виде "пуговки".
2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.
Реакция Кумбса (аптиглобулиновый тест)
Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh + эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антитела не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антителами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов.
Реакция преципитации
Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.
Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осторожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Реакцию применяют в судебной медицине для определения видовой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических исследованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кролика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наибольшее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.
Реакция преципитации в агаровом геле проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.
Реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтерлони). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердевания в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммунные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.
Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини). В растопленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических мо-норецепторных сыворотках.
Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направлению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образуются линии преципитации.
Реакции иммунного лизиса
Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфическими антителами, образует иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эритроциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.
Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритроцитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лаковую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.
Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, образуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.
Реакция ставится:
1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается,
2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам.
Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)-группы крови человека)
В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты . Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.
Рис. 3. Схема РПГА: эритроциты (1), нагруженные антигеном (3), связываются специфическими антителами (4).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.
Рис.4. Учет РНГА (РПГА).
Учет результатов рнга, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.
Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.
Рис. 3. Постановка и результат РНГА.
Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.
Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.
Реакция торможения гемагглютинации (ртга).
Рис. 8. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).
Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.
Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток
Рис. 9. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа
Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка) ; - гемагглютинация (зонтик).
Выводы: Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2
Оглавление темы "Иммуномодуляторы. Иммунодиагностика инфекционных заболеваний.":Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.
Разновидности реакции агглютинации (РА ) для выявления AT - кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хаддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).
Ориентировочная реакция агглютинации (РА)
Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки.
Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.
О-Аг . Соматические О-Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты.
Н-Аг . Н-Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками).
Vi-Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60-62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi-антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.
Реакции прямой гемагглютинации
Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов.
Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов из них.
Загрузка...